2-5-3- محرک و انتقال سیگنال53
2-5-3-1- انفجار اکسیداتیو 1 و اکسیژن فعال 2 ((ROS54
فصل سوم: بررسی منابع
3-1- مروری بر مطالعات کشت بافت در گیاهان دارویی59
3-2- مروری بر مطالعات کاربرد محرک ها در تولید متابولیت های ثانویه62
3-3- مطالعات انجام شده در مورد تأثیر محرک بر فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی و فعالیت آنزیم لیپوکسی ژناز64
فصل چهارم: مواد و روش ها
4-1- مواد گیاهی مورد استفاده68
4-1-1- کشت ساقه68
4-1-2- کشت برگ68
4-1-3- تهیه محیط MS به منظور کشت ریشه های مویین69
4-1-3-1 طرز تهیه استوک ها69
4-2- محرک های مورد استفاده72
4-2-1- تهیه استوک محرک ها73
4-2-1-1- استوک متیل جاسمونات73
4-2-1-2- استوک سالسیلیک اسید73
4-3- اندازه گیری میزان پروتئین کل از کالوس74
4-4-آسکوربات پراکسیداز75
4-4-1- محاسبه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز77
4-5- استخراج آرتمیزنین78
4-5-1- آماده سازی78
4-6- طرح و آنالیز های آماری79
فصل پنجم: نتایج
5-1- نتایج حاصل از کشت بافت A.annua81
5-2- نتایج حاصل از باززایی غیر مستقیم گیاه A. annua84
5-3- میزان آرتمیزنین در کالوس88
5-4- میزان پروتئین در کالوس گیاه درمنه خزری شاهد و تیمار شده با MJA و SA در زمان های مختلف90
5-5- فعالیت آنزیم ASC در کالوس گیاه درمنه خزری شاهد و تیمار شده با MJA وSA در زمان های مختلف 91
فصل ششم: منابع
6- منابع94
چکیده انگلیسی
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
2-1 ساختار گل در تیره کاسنی 17
2-2 تصویر A.annua 20
2-3 نمای ساده ای از مسیرهای عمده بیوسنتز محصولات ثانویه و ارتباط آنها با متابولیسم اولیه 27
2-4 اسکلت پایه فلاونوئید 29
2-5 مسیر بیوسنتز آرتمیزنین 32
2-6 شکل شماتیک از فعال شدن سیستم دفاعی گیاه در اثر تیمار با محرک 55
5-1 اثر هورمون 2,4-D بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی 83
5-2 اثر هورمون BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی 83
5-3 اثر متقابل هورمون 2,4-D و BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی 83
5-4 کالوس حاصل از ریزنمونه برگ 83
5-5 کالوس حاصل از ریزنمونه ساقه 83
5-6 اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی 87
5-7 اثر هورمون Kin بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی 87
5-8 اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه ساقه 87
5-9 گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم برگ 88
5-10 گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم ساقه 88
5-11 اثر متیل جاسمونات بر میزان آرتمیزنین در کالوس 89
5-12 میزان پروتئین در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و 150 ) و SA (mg/50 ml culture 2و4) در زمان های مختلف (120 و 48 ساعت) 91
5-13 فعالیت آنزیمASC در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و 150 ) و SA (mg/50 ml culture 2و4) در زمان های مختلف (120 و 48 ساعت) 92
فهرست جدول ها صفحه
2-1 گروههای اصلی ترکیبات مهم تجاری حاصل از گیاهان 51
3-1 مطالعات کشت بافت A.annua 61
3-2 مواد تشکیل دهنده محیط پایه Ms 71
5-1 اثر تیمارهای هورمونی بر درصد کالوس دهی 82
5-2 نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در القای کالوس 82
5-3 اثر تیمارهای هورمونی بر درصد باززایی 85
5-4 نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در باززایی غیرمستقیم 87
5-5 میزان آرتمیزنین در کالوس تیمار شده با µM 50 متیل جاسمونات و شاهد پس از 120 ساعت 89
5-6 اندازه گیری پروتئین بدست آمده از کالوس 90
5-7 فعالیت آنزیم ASC پس از اعمال تیمار 92
مقدمه
1-1- مقدمه
امروزه متابولیت های ثانویه1 به عنوان منبعی برای تولید دارو، افزودنی های غذایی، طعم دهنده ها و درمان بیماری ها به کار می روند (Sairam, R. et al. 2002). قدیمی ترین اطلاعات استفاده از گیاهان به عنوان دارو از سومریان و مصریان مربوط به حدود 1550 سال تا 3 هزار سال پیش از میلاد مسیح می باشد (اصغری، غ ر. 1385). ترکیبات طبیعی را می توان به عنوان ترکیبات راهنما برای طراحی منطقی داروهای جدید، توسعه الگو برداری از سنتز آنها و کشف اثرات درمانی جدید مورد استفاده قرار داد (اصغری، غ ر. 1385). گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از 2000 سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی2 مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین و کورستاژتین3 به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند. همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده 24 ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، 1و8- سینئول، پینوکاروون، بتا-سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، 1382). یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین4 از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم5 عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [08/1 – 01/0 درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002). کاربرد محرک های زنده6 (مانند: متیل جاسمونات7 و عصاره مخمر8) یک استراتژی مهم در تغییر میزان فعالیت آنزیم های دخیل در مسیر بیوسنتز متابولیت های ثانویه و در نتیجه افزایش تولید آنها می باشد (Zaho, J. et al. 2001).
بنابر این در این تحقیق اثرات محرک های9 مختلف (متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید10) بر تولید آرتمیزنین، تجمع پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز11 مورد بررسی قرار گرفته است.
1-2-اهداف پژوهش:
– معرفی بهترین هورمون جهت کالوس زایی در گیاه درمنه خزری.
– معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
– معرفی بهترین هورمون جهت باززایی.
– معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
– معرفی بهترین محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
– معرفی بهترین غلظت محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
– بررسی تغییرات میزان پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در برابر محرک.
1-2-ویژگی های گیاه شناسیArtemisia annua
درمنه (A.annua)از دولپه ای ها، راسته Asterales، خانواده Asteraceae و قبیله Anthemedeae است. گیاهی است یکساله، راست (برافراشته)، بدون کرک یا دارای کرک های پراکنده، ساقه منفرد به ارتفاع 100-30 سانتی متر، برگها 5-3 ×4-2 سانتی متر، دارای دمبرگی بلند، دو بار شانه ای منقسم، پانیکول بسیار بزرگ با شاخه های به طور تقریبی 25 سانتی متر، کلاپرکها متعدد، دمگل دار، واژگون، کروی، نهنج بدون کرک، جام گل لوله ای باز، پنج دندانه ای، زردرنگ می باشد که در گرگان، مازندران و گیلان از پراکنش نسبتا وسیعی برخوردار است.)مظفریان، ولی ا…، 68-1367(
2-1-1- گیاهشناسی تیره آستراسه (کاسنی)12
نام لاتین کاسنی از Aster، که یک واژه یونانی به معنای ستاره می باشد مشتق شده است و کمپوزیته، یک نام قدیمی اما هنوز معتبر برای این تیره است که اشاره به نوعی گل آذین مشخص دارد که از ویژگی های تیره آستراسه به حساب می آید (Cronquist 2001).
بزرگترین جنس های این تیره Senecio (1000 گونه)، Vernonia (1000گونه)، Centaurea (700 گونه)، Cousinia (600 گونه)، Helichrysum (550 گونه) و Artemesia (550 گونه) هستند (Wagenitz 1976).
اکثر اعضای تیره کاسنی ساختار علفی دارند، اما تعداد قابل توجهی نیز به شکل درختچه، تاک و درخت دیده می شوند (Judd, Campbell et al. 1999).
فرم رویشی گیاهان این تیره به صورت علفی یا خشبی، یکساله تا چند ساله است.
سیستم ریشه ای آنها راست ریشه13 با ساقه مستقیم و دارای برگ های متناوب، غالباٌ با بریدگی های گوناگون است. گل ها به صورت گلهای کناری در کپه های ناجور جنس ماده یا ماده عقیم، گلهای طبقی (لوله ای) نر ماده یا به ندرت ماده یا نر عقیم، عموماٌ ماده یا به تخمدان تقلیل یافته و از نظر عمل نر با لوله ای یا به ندرت لوله ای – نخی شکل، غالباٌ زرد یا به ندرت سبز مایل به قرمز (مظفریان 1387).
جام گل در این تیره سفید، قرمز یا زرد، زبانه ای یا پهن شده نامنظم و 2 تا 3 لوبه یا لوله ای باریک و با شکافهای نامنظم و دندانه دار یا به ندرت کاملاٌ لوله ای است.
میوه ها به صورت فندقه هم شکل یا به ندرت ناجور شکل، 2 تا 10 رگه ای یا 1 تا 3 باله، استوانه ای یا با سطح پشتی- شکمی فشرده هستند. کلاله در گل های این تیره وجود ندارد یا وجود دارد، کاهکی، تاج مانند یا گوشک دار مورب، به ندرت متشکل از فلس های بسیار باریک متعدد است. کیسه های بساک با قاعده دم دار یا به ندرت بدون دم، با رأس زایده دار است. خامه گل سربریده، با رأس قلم موئی، با کلاله خطی کناری است.
شکل 2-1: ساختار گل در تیره کاسنی
(Australian National Botanic Gardens 2011)
2-1-2-پراکنش جغرافیایی تیره آستراسه (کاسنی)
این تیره در سراسر جهان به استثنای قطب جنوب و قطب شمال توزیع شده، ودر مناطق خشک 14 و نیمه خشک 15 ، عرض های جغرافیایی معتدل ، نیمه گرمسیری و پایین شایعترین پوشش گیاهی است (Valles and McArthur 2000).
2-1-3-گیاهشناسی جنس آرتمیزیا (درمنه)

تا کنون بیش از 500 گونه برای این سرده شناسایی شده است (LI,Jiang et al.2012). فرم رویشی درمنه، علفی یا خشبی و بوته مانند ،یکساله دوساله تا چند ساله هستند. دارای سیستم ریشه ای، راست ریشه با ساقه برافراشته یا ایستاده، گاهی افتان و گسترده روی زمین، ساقه ها متعدد، در برخی گونه ها بدون انشعاب است. برگ هامتناوب، بدون کرک یا به اشکال گوناگون کرک دار، کرک ها 2 شاخه، به ندرت ستاره ای یا ساده، در بالا اغلب حاوی کرک های غده ای منقوط بدون پایک، پهنک شانه ای بخش یا شانه ای بریده یا 2 تا 4 بار شانه ای بخش، به ندرت ساده، دندانه دار، قاعده ای ها دمبرگ دار، برگ های ساقه ای اغلب بدون دمبرگ یا دمبرگ کوتاه دارند. گل آذین در گل های جنس آرتمیزیا با شمای عمومی گل آذین پانیکول یا سنبله ای- خوشه ای است.
گل های جنس آرتمیزیا همگی لوله ای، در کپه های جور جنس نر ماده، 5 دندانه ای، تعدادی از گلها عملاٌ عقیم یا در کپه های ناجور جنس کپه ها با گلهای کناری ماده لوله ای نخی شکل، در بالا 2 دندانه ای و گل های مرکزی نر ماده و بارور با رأس 5 دندانه ای یا در کپه های با گل های کناری ماده و گلهای مرکزی عملاٌ نر در بالا 5 دندانه ای. میوه به شکل فندقه، بدون کرک، بدون کاکل، مستعطیلی باریک، کوچک، با جای زخم ناشی از اتصال لوله گل جانبی و ناف قاعده ای جانبی است. (مظفریان. 1387).
2-1-4-پراکنش جغرافیایی جنس درمنه
گونه های این جنس در اکوسیستم های بسیاری شامل صحرا (A.santolina)، محیط های مرطوب در نزدیکی سطح دریا تا ارتفاعات بالا در حدود 4000 متر (A.melanolepis) رشد می کنند. برخی گونه ها نظیر A.vulgaris در مناطق پوشیده شده از مواد پوسیده و فاسد رشد می کنند .(Cox and Moore 2010)
گونه های درمنه به طور گسترده ای در نیمکره شمالی، (معمولاٌ در زیستگاههای خشک و نیمه خشک) پراکنده شده اند، اما در نیمکره جنوبی تنها در حدود 10 گونه از این جنس یافت شده است (Hayat, Ashraf et al. 2009).
2-1-5-گیاه شناسی گونه درمنه خزری (Artemisia annua)
گیاه درمنه خزری دارای ساقه منفرد به ارتفاع تا 120 سانتیمتر با برگ های بدون کرک یا با کرک های پراکنده، برگ های ساقه ای 2 بار شانه ای بخش، دمبرگ دار با قطعات اصلی جدا از یکدیگر، قطعات شانه ای بخش یا شانه ای منقسم با لوب های سر نیزه ای دندانه دار یا کامل، محور برگ عریان یا با دندانک های کم، برگ های بالای ساقه و لابه لای ساقه ها به تدریج کوچک شده، برگ های روی شخه های گل آذین بسیار کوچک و با تقسیمات خطی تا نخی است. گل آذینها پانیکول گسترده با شاخه های بلند، مورب تا تقریباٌ افقی گسترده دارند.
گل های کناری ماده و زمان گلدهی و میوه دهی در اواخر تابستان تا اواسط پائیز است. رویشگاه گیاه در ایران: شمال، غرب، مرکز و شمال شرق است.
شکل 2-2: A. annua

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2-1-6-تاریخچه نامگذاری
درمنه از دوران گذشته در طب سنتی دارای اهمیت و مصارف گوناگون بوده است و از آنها با نامهای درمنه، افسنطین، یوشان، برنجاسف، قیصوم و ترخون نام برده شده است و این نامها امروزه نیز در اکثر مناطق متداول است (مظفریان، ولی ا…، 68-1367)
نام Artemisia اولین بار در سال 1753 میلادی توسط لینه برای این جنس انتخاب شد. اقتباس این نام به افتخار زنی است که حدود 325 سال قبل از میلاد مسیح می زیسته و همسر حاکم وقت (مازلوس) قسمتی از یونان بود. وی داروساز و گیاهشناس بوده و چندین گیاه را نیز نامگذاری کرده بود.
درمنه، یوشان، ترخ (terekh) این جنس در ایران 34 گونه گیاهی علفی یکساله و چندساله دارد که در سراسر ایران پراکنده اند. گونه های انحصاری آن در ایران عبارتند از A. kermanensis و A.melanolepis و دیگر گونه های آن علاوه بر ایران در قفقاز، سیبری، ترکمنستان، افغانستان، پاکستان، آسیای مرکزی، ارمنستان، آناتولی، عراق، هیمالیا، تبت و اروپا نیز می رویند. پراکندگی جغرافیایی درمنه به وسعت ایران بوده از دشت های پست ساحلی تا ارتفاعات کوهستانی می رویند (مظفریان، و. 1386).
2-1-7- ترکیبات شیمیایی سرده درمنه
مونوترپن های بدون حلقه16 ، هیدروپراکسید مونوترپن ها17 ، گلیکوزید مونوترپن های حلقه دار18 و مونوترپن های غیر معمول در برخی از گونه های درمنه در ایران یافت شده اند (راستیان و مسعودی, 2011).
مهم ترین ترپن در گیاهان سرده آرتمیزنین می باشد که یک سزکویی ترپن لاکتون است. این ترکیب عمدتاٌ در بخش هوایی گیاه یافت می شود (Olofsson, Engstrom et al. 2011).
در سال 2008 در مطالعه ای بر روی A.scoparia، 24 مونوترپن، 19 سزکویی ترپن و 2 کتون در این گیاه شناسایی شد (Singh, Mittal et al. 2009).
روغن فرار19 درمنه اغلب حاوی بیش از 100 ترکیبجداگانه20 می باشد، به عنوان مثال در A.siberi بیش از 160 ترکیب شیمیایی شناسایی شده است (Rustaiyan and Masoudi 2011).
عمده ترین ترکیبات موجود در روغن بدست آمده از برگ و گل این گیاه شامل : کامفور21 ، -1,8 سینئول22، آلفا ترپینولن23، آلفا ترپینن24 می باشد (Movafeghi, Djozan et al. 2010). گیاهان این رده حاوی ترکیبات گلیکونی متعدد هستند. در تعدادی از گونه های این گیاه 80 آگلیکون آزاد25 شناسایی شده است (Al Hazimi and Basha 2011).
در سال 2010 طی مطالعات صورت گرفته، 18 ترکیب پلی فنلی26 در برگ های این گیاه شناسایی شد (Carvalho, Teixeira et al. 2011).
در مطالعه ای که بر روی 13 گونه درمنه صورت گرفت اسیدهای چرب غیر اشباع27 غالب در تمام گونه های درمنه آلفا لینولنیک اسید (ALA) و لینولئیک اسید (LA) تشخیص داده شد (Carvalho, Teixeira et al.2011).

دسته بندی : پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید